О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1-Гидропическая (вакуольная) дистрофия гепатоцитов
2-Баллонная дистрофия гепатоцитов
3-Воспалительная инфильтрация междольковой соединительной ткани
ЗАНЯТИЕ № 3
ТЕМА: Мезенхимальные дистрофии
№ 18 - АМИЛОИДОЗ ПЕЧЕНИ
Окраска: Конго красный
Балочное строение печени нарушено. Печеночные клетки и балки уменьшены в размерах, а местами вообще не определяются из-за отложения амилоидных масс, окрашенных в красно-оранжевый цвет. Амилоид откладывается в строме печени в стенках сосудов и желчных протоков
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1-Отложения жира в строме миокарда
2-Атрофия мышечных волокон
№22 -ГИАЛИНОЗ АРТЕРИОЛ СЕЛЕЗЕНКИ
Окраска: гематоксилин-эозин
В препарате селезенки следует найти центральные артериолы фолликулов. Стенка артериол резко утолщена, гомогенизирована, бесструктурна, окрашена в розовый цвет. Просветы артериол сужены, а местами вообще не определяются.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1.Печеночные клетки с пигментом гемосидерином
2. Гемосидерин в строме печени
№ 94 -ДИСТРОФИЧЕСКОЕ ОБЫЗВЕСТВЛЕНИЕ МИОКАРДА
Окраска: гематоксилин-эозин
В препарате виден миокард, в котором имеются разной величины и формы очаги обызвествления, окрашенные в темно-фиолетовый цвет. Они представляют собой группы мышечных волокон, подвергшихся дистрофии и некрозу с последующим пропитыванием их солями кальция. Вокруг очагов обызвествления отмечается лейкоцитарная инфильтрация как результат реактивного воспаления.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1.Атрофия печеночных балок и клеток
2.Зерна липофусцина в печеночных клетках
ЗАНЯТИЕ № 5
ТЕМА: НЕКРОЗ. ОБЩАЯ СМЕРТЬ .
№ 4- ИШЕМИЧЕСКИЙ ИНФАРКТ СЕЛЕЗЕНКИ
Окраска: гематоксилин-эозин
В препарате можно различть три зоны:
первая зона – зона некроза -представлена участком бесструктурной массы (детритом), слабо окрашенным эозином в розовый цвет с наличием осколков ядер; вторая зона – демаркационная зона – характеризуется наличием расширенных сосудов с кровоизлияниями и слабо выраженной инфильтрацией нейтрофилами, что свидетельствует о «свежести» некроза; третья зона- не измененная ткань селезенки.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1- Клубочек с сохранившимися ядрами
2- Безъядерные извитые канальцы
3- Прямые канальцы с сохранившимися ядрами
4- Межуточное вещество с сохранившимися ядрами
№5 -ИНКАПСУЛИРОВАННЫЙ ОБЫЗВЕСТВЛЕННЫЙ ОЧАГ
ТВОРОЖИСТОГО НЕКРОЗА В ЛИМФОУЗЛЕ (при туберкулезе)
Окраска: гематоксилин-эозин
Строение лимфоузла нарушено, определяются сливающиеся очаги казеозного некроза, окрашенные эозином в розовый цвет. Кое-где в детрите выявляются осколки ядер, окрашенные гематоксилином в бледно-синий цвет. Вокруг некроза возникло продуктивное воспаление и формируется соединительнотканная капсула.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1-Очаги творожистого некроза
2- Зона демаркационного воспаления с образованием капсулы
ЗАНЯТИЕ № 6
ТЕМА: НАРУШЕНИЯ КРОВО- И ЛИМФООБРАЩЕНИЯ – 1 занятие.
(полнокровие, малокровие, кровотечение, кровоизлияния, плазморрагия, нарушения содержания тканевой жидкости, нарушения лимфообращения)
№ 1 - МУСКАТНАЯ ПЕЧЕНЬ
Окраска:гематоксилин-эозин
В препарате видна ткань печени. Балочное строение долек печени сохранено, однако центральные вены и впадающие в них синусоиды резко расширены, переполнены кровью. Синусоиды на периферии долек имеют обычный вид. Гепатоциты в центре долек резко уменьшены в размерах, атрофированы, а местами не определяются. Гепатоциты на периферии долек сохранены, местами с дистрофическими изменениями.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1- Расширенные и полнокровные центральные вены
2- Расширенные и полнокровные синусоиды центральных отделов долек
3- Атрофия и некроз печеночных клеток в центре долек
4- Сохранившиеся гепатоциты периферических отделов долек
№ 2 -БУРАЯ ИНДУРАЦИЯ ЛЕГКОГО
Окраска: гематоксилин-эозин
В препарате видна ткань легкого с расширенными межальвеолярными перегородками и суженными просветами альвеол. Межальвеолярные перегородки расширены за счет разрастания в них соединительной ткани, а также за счет полнокровия кровеносных сосудов, вокруг которых можно видеть диапедезные кровоизлияния. В межальвеолярных перегородках и в просветах альвеол содержатся скопления макрофагов, поглотивших гемосидерин и называющихся гемосидерофагами (окрашиваются в коричневый цвет). В просветах альвеол можно видеть отечную жидкость, окрашенную эозином в слабо розовый цвет.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1-Утолщенные и склерозированные альвеолярные перегородки
2-Расширенные и переполненные кровью сосуды
3-Скопления гемосидерофагов
4-Отечная жидкость в альвеолах
Окраска: гематоксилин-эозин
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1-Полнокровие сосудов легкого
2-Скопление отечной жидкости в полостях легочных альвеол
3-Раковые эмболы в просвете лимфатических сосудов
№81- ОБТУРИРУЮЩИЙ ТРОМБ С ОРГАНИЗАЦИЕЙ, КАНАЛИЗАЦИЕЙ
И ВАСКУЛЯРИЗАЦИЕЙ
Окраска: гематоксилин-эозин
В препарате - поперечный срез сосуда, просвет которого выполнен соединительной тканью, заместившей обтурирующий тромб и остатками тромба. Граница между интимой и соединительной тканью неразличима. Среди соединительной ткани видны множественные мелкие и единичные крупные каналы, выстланные эндотелием (это вновь образованные сосуды).
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1-Зона некроза
2-Зона демаркационного воспаления
3. Неизмененная ткань почки:
№ 8 -КРАСНЫЙ ТРОМБ В АРТЕРИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА
Окраска: гематоксилин-эозин
Просвет артерии заполнен гомогенными эозинофильными массами - красным тромбом
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1-Миокард
2-Фибрин на поверхности эпикарда
3-Грануляционная ткань, врастающая в фибрин.
№ 42 - ГНОЙНЫЙ МЕНИНГИТ
Окраска: гематоксилин-эозин
Мягкие мозговые оболочки резко утолщены преимущественно за счет инфильтрации гнойным экссудатом, состоящим из множества нейтрофильных лейкоцитов. Сосуды оболочек резко расширены, полнокровны. Ткань головного мозга существенно не изменена.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1-Гнойный экссудат в мозговых оболочках
2-Полнокровные сосуды мозговых оболочек
3-Ткань головного мозга
№ 104- СЕРОЗНО-ГНОЙНАЯ ПНЕВМОНИЯ
Окраска: гематоксилин-эозин
Просветы альвеол выполнены экссудатом различного состава. В одних -экссудат состоит из гомогенной белковой массы, однородно окрашенной эозином в розовый цвет, с небольшой примесью нейтрофильных лейкоцитов и клеток слущенного альвеолярного эпителия, что соответствует серозному воспалению. В других альвеолах в экссудате преобладают нейтрофильные лейкоциты, что характерно для гнойного воспаления. Наличие в одном и том же препарате фокусов серозного и гнойного воспаления позволяет назвать его серозно-гнойной пневмонией. В межальвеолярных перегородках определяются расширенные полнокровные сосуды и слабо выраженная лейкоцитарная инфильтрация.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1-серозный экссудат в просвете альвеол
2-гнойный экссудат в просвете альвеол
ЗАНЯТИЕ № 9
ТЕМА: Продуктивное воспаление
№ 52- МИЛИАРНЫЙ ТУБЕРКУЛЕЗ ЛЕГКИХ
Окраска: гематоксилин-эозин
В легочной ткани обнаруживаются множественные гранулемы, состоящие преимущественно из эпителиоидных клеток. В некоторых гранулемах определяются одна-две гигантские многоядерные клетки Пирогова-Лангханса с характерным расположением ядер в виде частокола по периферии клетки. В периферических отделах бугорка обнаруживается вал из лимфоцитов с небольшой примесью плазматических клеток. В некоторых бугорках обнаруживаются фокусы творожистого некроза.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
2-Обызвествленная соединительнотканная капсула
3-Реактивное воспаление вокруг пораженного мышечного волокна
№ 56- ЦИСТИЦЕРКОЗ ГОЛОВНОГО МОЗГА(ветвистая форма)
Окраска: гематоксилин-эозин
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
2 –Клетки Микулича
3 –Гиалиновые шары
ЗАНЯТИЕ № 10
ТЕМА: Процессы компенсации и адаптации
№ 55- ЖЕЛЕЗИСТАЯ ГИПЕРПЛАЗИЯ ЭНДОМЕТРИЯ
Окраска: гематоксилин-эозин
В препарате представлен соскоб эндометрия. Эндометрий резко утолщен в связи с наличием большого количества маточных желез (крипт) отличающихся большим разнообразием по величине и форме. Однако все железы выстланы однослойным призматическим эпителием. Строма эндометрия сочная, отечная, местами инфильтрирована лейкоцитами.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1-Резкое утолщенные мышечные волокна
2-Увеличенные в размерах мышечные ядра
№ 109- ГИПЕРТРОФИЯ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ (коллоидный зоб)
Окраска: гематоксилин-эозин
Фолликулы щитовидной железы различной формы, многие из них резко увеличены в размере, заполнены коллоидом. Эпителиальные клетки фолликулов уплощены.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1- сосочковые разрастания, покрытые эпителием
№ 67- АДЕНОКАРЦИНОМА ТОЛСТОЙ КИШКИ
Окраска: гематоксилин-эозин
В препарате виден фрагмент стенки толстой кишки, в одном участке которого стенка кишки имеет обычное строение. В другом участке определяется опухоль, представленная атипичными эпителиальными клетками, формирующими атипичные железы. Опухоль инвазирует подслизистый и мышечный слои стенки кишки.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1- Гнезда раковых клеток
2-Раковые жемчужины (центры ороговения)
№ 64- СКИРР ГРУДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Окраска: гематоксилин-эозин
Опухоль представлена мелкими группами или скоплениями атипичных гиперхромных малодифференцированных раковых клеток, расположенных среди широких прослоек зрелой волокнистой гиалинизированной соединительной ткани. Таким образом, в опухоли строма преобладает над паренхимой.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1- Гнезда опухолевых клеток
2-Гиалинизированная строма опухоли
ЗАНЯТИЕ № 12
ТЕМА: Эпителиальные опухоли органоспецифические
№ 80 -ХОРИОНЭПИТЕЛИОМА
Окраска: гематоксилин-эозин
В препарате представлена ткань матки. В миометрии разрастается опухолевая ткань, построенная из двух видов клеток: 1) клеток округлой и полигональной формы со светлой цитоплазмой и рыхлым, окрашенным в сиреневый цвет ядром (это клетки цитотрофобласта, клетки Лангханса), 2) крупных, уродливой формы клеточных симпластов с интенсивно окра-шенными множественными ядрами. Эти клетки образуют синтиций и называются синтициальными клетками. Описанные два вида клеток имеют сходство с хориальным эпителием ворсин, который является источником развития опухоли. Между клетками опухоли имеются кровяные лакуны, или «озера». Собственная строма в опухоли отсутствует.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1 - Крупные полигональные клетки, формирующие разной величины островки
2 - Узкие прослойки соединительной ткани, разделяющие клеточные островки опухоли
№ 15 -ФИБРОАДЕНОМА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Окраска: гематоксилин-эозин
Опухоль состоит из 2 компонентов: а) причудливо разрастающихся резко деформированных протоков с едва различимыми просветами; б) соединительной ткани. В одних участках опухоли соединительная ткань разрастается концентрически вокруг протоков и поэтому фиброаденома называется периканаликулярной, в других - соединительная ткань выпячивается в просвет протоков, их просвет становится щелевидным, что называется интраканаликулярной фиброаденомой.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1- опухолевые клетки, расположенные концентрически
2- псаммозные тельца
№ 108- НЕВРИНОМА (ШВАННОМА)
Окраска: гематоксилин-эозин
В препарате видна опухоль, построенная из клеток шванновской оболочки периферических нервных стволов. Она состоит из однородного цитоплазматического синтиция с наличием палочковидных ядер, образующих группы, в виде палисадных фигур - это полисадные структуры или тельца Верокаи.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1-Пучки гладкомышечных волокон
2-Пучки соединительнотканных волокон
ЗАНЯТИЕ № 14
ТЕМА: Опухоли кроветворной и лимфатической тканей
№ 32 -ЛИМФОГРАНУЛЕМАТОЗ
Окраска: гематоксилин-эозин
Строение лимфоузла резко изменено. В нем разрастается опухолевая ткань, состоящая из многоядерных клеток Березовского-Штернберга-Рид, больших и малых клеток Ходжкина. Определяются также эозинофилы, а количество лимфоидных клеток резко уменьшено. Кроме этого отмечаются склероз и очаги некроза опухоли.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1-Дольки печени
2-Скопления лейкозных клеток по периферии долек (лимфомы)
№141- ПЕЧЕНЬ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ МИЕЛОИДНОМ ЛЕЙКОЗЕ
Окраска: гематоксилин-эозин
По ходу синусоидов внутри печеночных долек и в меньшей степени в портальных трактах отмечается диффузное разрастание лейкозных клеток миелоидного ряда.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1. Диффузная лейкозная инфильтрация
ЗАНЯТИЕ № 15
ТЕМА: Атеросклероз. Артериальная гипертензия. Ишемическая болезнь сердца. Сосудистые заболевания нервной системы.
№ 8- ДИАПЕДЕЗНЫЕ КРОВОИЗЛИЯНИЯ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ
Окраска: гематоксилин-эозин
В ткани головного мозга видны мелкие и более крупные кровоизлияния, которые расположены преимущественно вокруг расширенных и резко полнокровных сосудов. Стенки сосудов местами неразличимы вследствие обильного пропитывания их эритроцитами. Кое-где можно видеть глыбки бурого пигмента гемосидерина, свидетельствующие о начале рассасывания ранее излившихся кровяных масс.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1- Некротизированные мышечные волокна, лишенные ядер
2- Клеточная инфильтрация и очаги кровоизлияний
3- Нормальная мышечная ткань
№ 130- АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКАЯ БЛЯШКА КОРОНАРНОЙ АРТЕРИИ
Окраска: пикрофуксином по Ван-Гизон
Просвет артерии резко сужен в связи с резким диффузным утолщением стенки за счет отложения липоидных масс с последующим разрастанием в ней соединительной ткани. Внутренняя эластическая мембрана оттеснена к средней оболочке.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1-Очаг дезорганизации
2-Тромботические массы
3-Воспалительная инфильтрация
4-Разрастание соединительной ткани.
№ 83- РЕВМАТИЧЕСКИЙ МИОКАРДИТ
Окраска: гематоксилин-эозин
В расширенных межмышечных прослойках вокруг сосудов видны гранулемы. Это клеточные инфильтраты, состоящие преимущественно из лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов и эозинофилов, а также – фибробластов.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1-разрастание опухоли - аденокарциномы
№ 93 - ХРОНИЧЕСКАЯ ЯЗВА ЖЕЛУДКА С ОБОСТРЕНИЕМ
Окраска: гематоксилин-эозин
В стенке желудка имеется глубокий дефект, захватывающий слизистую и подслизистую оболочки. В области дефекта один край слизистой оболочки подрыт, другой пологий. В дне дефекта определяются: а) фибринозно-гнойный экссудат, б) фибриноидный некроз, в) грануляционная ткань, г) соединительная ткань.
О Б О З Н А Ч Е Н И Я:
1- Обильная инфильтрация слоев стенки отростка лейкоцитами
2- Язвенные дефекты в слизистой отростка
№ 144- ОСТРЫЙ ПАНКРЕАТИТ
©2015-2019 сайт
Все права принадлежать их авторам. Данный сайт не претендует на авторства, а предоставляет бесплатное использование.
Дата создания страницы: 2016-08-07
Окраска гематоксилин-эозином - наиболее распространённый метод окрашивания срезов. Этот методпозволяет установить отношения между частями органа, отлично выявляя все клеточные элементы и некоторые неклеточные структуры. Практически во всех случаях независимо от поставленной задачи применяется окраска гематоксилин-эозином. В большинстве случаев для изучения структуры нормального или измененного в результате болезни органа ограничиваются этим методом окраски. В других случаях, когда перед исследователем стоит специальная задача, пользуются особыми методами, окрашивая в то же время параллельно ряд срезов гематоксилин-эозином.
Эта окраска является двойной: гематоксилин - основной краситель - окрашивает ядра клеток, эозин - кислый краситель - красит протоплазму клеток и в меньшей степени - различные неклеточные структуры.
7. Что понимается под термином базофильная окраска гистологических структур?
Окрашивание клеточных и тканевых структур основными красителями.
8. Что понимается под термином оксифильная окраска гистологических структур?
Окрашивание клеточных и тканевых структур кислыми красителями.
9. Электронно-микроскопические методы исследования гистологических препаратов.
Электронно-микроскопическая цитохимия, Электронно-микроскопическая иммуноцитохимия и Электронно-микроскопическая авторадиография
10. Гистохимические методы исследования гистологических препаратов.
а) Гистохимические методы основаны на специфической реакции между химическим реактивом и определённым компонентом препарата. б) Образующийся продукт реакции имеет окраску, отличную от окраски исходного реактива.
|
1а) РНК |
Реакция Браше. 1. Реактив (как отмечалось, - смесь двух красителей: метилового зелёного и пиронина. 2. а) А. Пиронин специфически окрашивает РНК в красный цвет . Б. Поэтому на препарате ядрышки (в составе ядра) и рибосомбогатые участки цитоплазмы имеют красный цвет. б) Другие структуры ядра (помимо ядрышек) - зелёные . 3. Обычно делают и контрольный препарат, который перед окрашиванием обрабатывают рибонуклеазой. |
|
1б) ДНК |
Реакция Фёльгена. 1. Основной реактив - фуксинсернистая кислота (реактив Шиффа). 2. ДНК-содержащие структуры окрашиваются в пурпурно-красный цвет . |
|
2. Белки |
Используются различные реакции; в том числе: а) с бромфеноловым синим (у белков - тёмно-фиолетовая окраска ); б) со смесью нингидрин-реактив Шиффа (белки приобретают красный цвет ). |
|
3а) Полисахариды |
ШИК-реакция. 1. Реактив - Ш ифф-пер и одная к ислота (выделенные буквы и составляют аббревиатуру ШИК ). 2. Периодат способствует образованию в субстрате альдегидной группы, которая взаимодействует с реактивом Шиффа. 3. На препарате ШИК-положительные компоненты (например, гранулы гликогена) имеют тёмно-красный цвет . |
|
3б) Гликозамин- гликаны |
Реакция с толуидиновым синим. 1. При взаимодействии толуидинового синего с веществами, содержащими много кислотных групп, наблюдается метахромазия - изменение окраски с синей на фиолетовую и красную. 2. Подобным свойством обладают, в частности, компоненты аморфного вещества соединительной ткани - гликозамингликаны (являющиеся, как известно, гетерополисахаридами с высоким содержанием кислотных радикалов). |
|
4. Нейтральный жир |
Реакция с суданом III (о которой уже упоминалось). Капли жира в жировой клетке окрашиваются в яркий оранжево-красный цвет благодаря растворению в них красителя. |
Методика контрастирования (окраски) парафиновых срезов Гематоксилином и эозином (г.-э)
1) Парафиновые срезы, наклеенные на предметные стёкла, освобождают от парафина (депарафинизируют) поочерёдно погружая их в 2 Порции ксилола (толуола, бензола) – По 3 мин.
2) Производят гидратацию срезов путём поэтапного помещения их в спирты убывающей концентрации (96º, 80º, 60º, 40º, а затем в дистиллированную воду На 3-4 мин .
3) Окрашивают срезы сначала раствором ядерного (основного) красителя - гематоксилина – В течение 2 мин.
4) После этого срезы переносят в водопроводную воду, которая имеет щелочную среду, для окисления гематоксилина. При этом он приобретает синий цвет, а затеи всполаскивают в дистиллированной воде.
5) Окрашивают срезы раствором цитоплазменного (кислого) красителя - Эозина – в течение 0,5-1 мин.
6) Избыток красителя смывают дистиллированной водой в течение 1 мин.
7) Окрашенные срезы обезвоживают. Для этого их помещают в Спирты возрастающей концентрации – поочерёдно в спирты 40º, 60º, 80º, 96º, и 100º – По 1-2 мин.
8) Обезвоженные срезы просветляют в карбол-ксилоле, а затем - в двух порциях ксилола – по 2 мин .
9) Заключение срезов: на срез стеклянной палочкой наносят маленькую каплю раствора канадского бальзама (полистирола, дамар-лака и др.) и накрывают обезжиренным покровным стеклом, осторожно опуская его под углом, стремясь избежать попадания пузырьков воздуха. Сверху можно поместить небольшой грузик для удаления избытка бальзама (полистирола).
Оценка результатов окрашивания
Гематоксилин является щелочным (основным) красителем. Он окрашивает структуры клеток и тканей, имеющие кислую среду, например, ДНК и РНК в ядрах клеток, кислые гликозаминогликаны в межклеточном веществе соединительной ткани. Поэтому такие структуры называются Базофильными (от лат. Basis – основание). В окрашенном гематоксилином микропрепарате ядра клеток будут тёмно-синими или тёмно-фиолетовыми.
Эозин (от греч. заря) имеет красный или розовый цвет и является кислым красителем. Поэтому окрашивающиеся им щелочные компоненты клеток или неклеточных структур называются Оксифильными, Или ацидофильными (от греч. Oxy Или лат. Acidum – кислота), Или эозинофильными .
Следует учесть, что цитоплазма разных клеток может окрашиваться как базофильно, так и эозинофильно. Например, клетки, активно синтезирующие белковые компоненты, содержат в цитоплазме большое количество рибосом (а, следовательно, и РНК), поэтому их цитоплазма окрашивается Базофильно . Если структуры цитоплазмы окрашиваются одновременно и основными, и кислыми красителями, то они называются Нейтрофильными , или Гетерофильными .
Есть целый ряд красителей, например тиазинового ряда (азур, толуидиновый синий, метиленовый синий и др.), которые при взаимодействии с компонентами клеток и тканей изменяют свой цвет на им несвойственный (синий на красный или фиолетовый; чёрный на жёлтый или зелёный и т. д.). Такое явление получило название Метахромазия.
При соблюдении правил приготовления микропрепаратов и применении стойких красителей постоянные микропрепараты Могут сохраняться десятилетиями, не утрачивая своих первоначальных качеств.
Следует помнить , что ядерные и цитоплазменные красители обычно связываются с окрашиваемыми структурами в количествах, пропорциональных содержанию в них реагирующих компонентов. На этом основана Количественная цито - И гистохимия.
Методика заливки в желатин.
Метод пригоден для эмбриологических. исследований, заливки рыхлых тканей и органов (не вызывает сморщивания), при исследованиях с целью выявления жиров и липоидов. Режут желатиновый блок только на замораживающем микротоме.
Для заливки приготавливают два раствора:
а) 25% раствор: 25 г размельченной или порошкообразной желатины растворяют в водяной бане (при 37°) в 75 мл 1 % карболовой воды (во избежание испарения сосуд должен быть закрыт);
б) 12,5% раствор: 1 часть густого раствора разбавляют 1 частью теплой 1% карболовой воды. Для приготовления последней в 100 мл дистиллированной воды растворяют 1 г карболовой кислоты при постоянном взбалтывании.
Приготовленные растворы желатины разливают в отдельные пробирки или другие небольшие сосуды порциями,
Для его приготовления 2,0 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96% спирта и к полученному раствору добавляют 100 мл дистиллированной воды, 100 мл глицерина, 3,0 г калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности. Полученный раствор необходимо поставить на свету и при доступе воздуха не менее чем на 15 дней с тем, чтобы гематоксилин успел окислиться в гематеин, который и является красящим веществом. Банку с раствором при этом накрывают бумажным колпачком или сложенной в несколько раз марлей. Гематоксилин Эрлиха окрашивает ядра в синий цвет. Для окраски цитоплазмы используют 1% водный раствор эозина.
Эта методика наиболее часто применяется и поэтому должна быть описана более детально. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Замороженные срезы перед окрашиванием следует обезжирить, поместив их на 20-30 мин или на ночь в 96% спирт. Далее срезы переносят в дистиллированную воду. Целлоидиновые срезы переносят из одного бюкса в другой с помощью препаровальной иглы с загнутым концом. Депарафинированные и замороженные срезы можно окрашивать на предметном стекле, наливая или сливая соответствующие растворы. Растворы красителей при этом можно сливать обратно для повторного использования.
Порядок окрашивания срезов гематоксилин-эозином следующий :
1) срезы переносят в дистиллированную воду;
2) окрашивают гематоксилином Эрлиха 2-5 мин;
3) промывают в дистиллированной воде;
4) затем промывают в водопроводной воде 3-5 мин;
5) осуществляют контроль под микроскопом;
6) дифференцируют 1% раствором хлористоводородной кислоты в 70° спирте 1-2 с;
7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин при частой смене; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей;
8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом);
9) промывают в дистиллированной воде;
10) 1% водный раствор эозина 0,5-1 мин;
11) промывают в дистиллированной воде (и дифференцируют, так как вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза;
12) проводят обезвоживание, осветляют в ксилоле, заключают в бальзам. В спиртах эозин также отмывается, так что проводить срезы по спиртам следует быстро. Время окрашивания в гематоксилине нужно установить на первых 2-3 срезах и затем все срезы данного блока окрашивать одинаково. Дифференцировку в растворе хлористоводородной кислоты в спирте можно не проводить, но в этом случае структуры ядра будут менее четкими и в цитоплазме может быть синеватый фон.
1. Депарафинировать в ксилоле - 2 мин.
2. Удалить ксилол 96° спиртом - 2 мин. Затем стекло со срезами поместить в дистиллированную воду - 2 мин (можно дольше).
3. Окрашивание: на срез нанести каплю раствора гематоксилина на 2-З мин.
4. Срез поместить в водопроводную воду на 5- 10 мин (можно на сутки, тогда гематоксилин лучше "вызреет" и окраска будет лучше).
5. Срез ополоснуть дистиллированной водой и нанести каплю раствора эозина - 1 мин.
6. Сполоснуть в 2-3 порциях дистиллированной воды по 0,5-1 мин в каждой.
7. Обезводить в двух порциях 96° спирта по 1 мин в каждом (лучше капать из капельницы).
8. Окончательно обезводить в 100° спирте или карбол-ксилоле – 1 мин.
9. Просветлить срез ксилолом - 2 мин.
10.Заключить срез в бальзам и покрыть покровным стеклом.
После этого препарат подсушивают, чтобы бальзам затвердел. Хранят препараты в защищенном от света месте.
Методика окрашивания гематоксилином
и эозином целлоидиновых срезов
1. Окрасить в гематоксилине в течение 2-3 мин.
2. Промыть сначала в водопроводной, а затем в дистиллированной воде по 2-5 мин.
3. Окрасить в эозине в течение 1-2 мин.
4. Промыть в дистиллированной воде в течение 0,5-1 мин.
5. Обезводить в спиртах восходящей концентрации (70 %, 96 %, 100 %) по 1-2 мин.
6. Просветлить в карбол-ксилоле и ксилоле по 2-3 мин.
7. Заключить окрашенные срезы в бальзам.
Окрашивание срезов для обзорных целей
Различают методы окраски для обзорных целей, применяемые для получения общего представления о морфологии ткани или органа, и специальные, предназначенные для выявления определенных элементов клетки или ткани (например, комплекса Гольджи, митохондрий, эластических волокон соединительной ткани и т.д.). Ниже рассматриваются лишь некоторые методы окрашивания для обзорных целей. Суть их обычно заключается в том, что при этом окрашиваются ядра и каким-то контрастным красителем – цитоплазма.
Ядерные (основные) красители. Для окрашивания ядер используются гематоксилин, кармин, сафранин и другие основные красители. Существует несколько способов приготовления растворов гематоксилина. Наиболее распространенным является гематоксилин Эрлиха.
Гематоксилин Эрлиха. Для его приготовления 2,0 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96% спирта и к полученному раствору добавляют 100 мл дистиллированной воды, 100 мл глицерина, 3,0 г калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности. Полученный раствор необходимо поставить на свету и при доступе воздуха не менее чем на 15 дней с тем, чтобы гематоксилин успел окислиться в гематеин, который и является красящим веществом. Банку с раствором при этом накрывают бумажным колпачком или сложенной в несколько раз марлей. Гематоксилин Эрлиха окрашивает ядра в синий цвет. Его используют при окрашивании срезов гематоксилин-эозином (см. ниже).
Железный гематоксилин Гейденгайна окрашивает в черный цвет не только ядра, но и митохондрии, темные диски скелетной и сердечной мышечной ткани и другие структуры. Для его приготовления 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96% спирта, добавляют 90 мл дистиллированной воды и оставляют созревать на срок не менее 4 недель. Перед окрашиванием срезы протравливают в течение 2-12 ч в 2,5% растворе железоаммиачных квасцов. Раствор квасцов получают за счет 4-кратного разведения исходного 10% раствора, для приготовления которого используются кристаллы квасцов только фиолетового цвета. После промывания в дистиллированной воде срезы окрашивают в течение 1-36 ч раствором гематоксилина, разведенным вдвое по сравнению с исходным. В зависимости от исследуемого материала можно использовать и большие разведения красителя. Окрашенный срез ополаскивают дистиллированной водой и дифференцируют под контролем микроскопа в растворе железоаммиачных квасцов. После этого срезы промывают в водопроводной воде не менее 30 мин при частой смене воды.
Железный гематоксилин Вейгерта готовят в виде двух основных растворов - раствора Вейгерта I и раствора Вейгерта II. Раствор Вейгерта I представляет собой 1% раствор
гематоксилина в 90% спирте (1 г гематоксилина на 100 мл спирта). Раствор Вейгерта II имеет следующий состав: официнальный раствор полуторахлористого железа 4 мл, 1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,15-1,19) и 95 мл дистиллированной воды. Официнальный раствор полуторахлористого железа – это 50% раствор водного хлорного железа (FеСl 3 , 6Н 2 0). Перед употреблением смешивают равные объемы основных растворов. Основные растворы хранятся 3-4 мес. Смешанный раствор можно применять лишь несколько дней. Время окрашивания 1-5 мин. Затем следует промывка водопроводной водой. Срезы можно дифференцировать 0,1% раствором хлористоводородной кислоты в 70% спирте, после чего их тщательно промывают водопроводной водой. Железный гематоксилин Вейгерта должен окрашивать ядра в черный цвет. Если они приобретают коричневый цвет, то это свидетельствует о порче красителя.
Квасцовый карминприготовляют, растворяя 3-5 г аммиачных квасцов в 100 мл дистиллированной воды при нагревании, и добавляют 1 г кармина. Раствор кипятят 15 мин, охлаждают, фильтруют и добавляют 1 мл формалина. Время окрашивания – 0,5-24 ч, дифференцировка в дистиллированной воде проводится до прекращения отдачи красителя. Ядра окрашиваются в ярко-красный цвет. Окраску кармином можно проводить после импрегнации серебром или при выявлении железа.
Сафранин является прекрасным ядерным красителем, особенно для материала, фиксированного в растворах, содержащих осмий или хром. 10 г чистого сафранина или сафранина «С-ехtrа» (качество красителя имеет очень большое значение) растворяют в смеси 155 мл 96% спирта со 145 мл дистиллированной воды. Из полученного таким образом основного раствора перед употреблением берут 20 мл и добавляют 80 мл 50% спирта. Время окрашивания 24 ч. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы дифференцируют, контролируя под микроскопом в 0,1% растворе хлористоводородной кислоты в абсолютном спирте. Затем следует промывка абсолютным спиртом, просветление в ксилоле, заключение в бальзам.
Кислые красители. Эти красители не являются избирательно цитоплазматическими. Красители для цитоплазмы подбирают таким образом, чтобы их цвет хорошо контрастировал с окраской ядер. Для докрашивания цитоплазмы после окраски ядер гематоксилином чаще всего используется 1% водный раствор эозина. Для срезов, окрашенных кармином, используют раствор пикриновой кислоты, полученный путем разведения водой насыщенного раствора пикриновой кислоты в отношении 1:3 (при комнатной температуре в 100 мл воды растворяется примерно 1,2 г пикриновой кислоты, следовательно, для получения насыщенного раствора следует взять чуть больше этого количества пикриновой кислоты). Время окрашивания 2-5 мин. Цитоплазма клеток и эритроциты красятся в желтый цвет.
Методика окрашивания срезов гематоксилин-эозином. Эта методика наиболее часто применяется и поэтому должна быть описана более детально. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Замороженные срезы перед окрашиванием следует обезжирить, поместив их на 20-30 мин или на ночь в 96% спирт. Далее срезы переносят в дистиллированную воду. Целлоидиновые срезы переносят из одного бюкса в другой с помощью препаровальной иглы с загнутым концом. Депарафинированные и замороженные срезы можно окрашивать на предметном стекле, наливая или сливая соответствующие растворы. Растворы красителей при этом можно сливать обратно для повторного использования.
Порядок окрашивания срезов гематоксилин-эозином следующий: 1) срезы переносят в дистиллированную воду;
2) окрашивают гематоксилином Эрлиха 2-5 мин;
3) промывают в дистиллированной воде;
4) затем промывают в водопроводной воде 3-5 мин;
5) осуществляют контроль под микроскопом;
6) дифференцируют 1% раствором хлористоводородной кислоты в 70° спирте 1-2 с;
7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин при частой смене; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей;
8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом);
9) промывают в дистиллированной воде;
10) 1% водный раствор эозина 0,5-1 мин;
11) промывают в дистиллированной воде (и дифференцируют, так как вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза;
12) проводят обезвоживание, осветляют в ксилоле, заключают в бальзам. В спиртах эозин также отмывается, так что проводить срезы по спиртам следует быстро. Время окрашивания в гематоксилине нужно установить на первых 2-3 срезах и затем все срезы данного блока окрашивать одинаково. Дифференцировку в растворе хлористоводородной кислоты в спирте можно не проводить, но в этом случае структуры ядра будут менее четкими, и в цитоплазме может быть синеватый фон.
Методика окрашивания азур-2-эозином. Эта методика также вполне пригодна для обзорных целей. Прогрессивный метод окрашивания азур-2-эозином довольно ненадежен, но регрессивный дает стабильные результаты. Основными растворами являются 0,1% водный раствор азура и 0,1% водный раствор эозина. Для приготовления рабочего раствора на 100 мл дистиллированной воды добавляют 100 капель основного раствора азура и 100-120 капель раствора эозина. Срезы помещают в раствор красителя на 12-24 ч. Затем срезы дифференцируют. Методы дифференцировки могут быть разными в зависимости от того, насколько интенсивно окрасились срезы. Дифференцировку можно проводить в подкисленной дистиллированной воде, затем промывать в чистой дистиллированной воде, обезвоживать в спиртах, просветлять в ксилоле и заключать в бальзам. При этом следует учесть, что в спиртах дифференцировка продолжается. Можно дифференцировать срезы прямо в 96% спирте. Ход дифференцировки контролируют под микроскопом. Окрасив несколько срезов, можно контролировать на глаз по цвету среза, время от времени выборочно проверяя качество окраски под микроскопом.
Методика окрашивания железным гематоксилин-пикрофуксином по Ван-Гизону. Срез окрашивают железным гематоксилином Вейгерта в течение 2-5 мин. Вместо гематоксилина Вейгерта можно использовать гематоксилин Эрлиха. Дифференцировки не требуется, так как срезы дифференцируются в пикрофуксине. Для приготовления раствора пикрофуксина к 100 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты добавляют 10 мл 1% водного раствора кислого фуксина. Раствор пикрофуксина хранится длительное время. После окрашивания железным гематоксилином срезы ополаскивают в дистиллированной воде и переносят в пикрофуксин на 3-5 мин. Затем промывают дистиллированной водой, обезвоживают в спиртах, начиная с 96%, проводят через ксилол и заключают в бальзам. В воде смывают фуксин. Если пропустить промывку в воде – обсушить срез фильтровальной бумагой, что иногда делают, мышечная ткань может быть окрашена в розовый цвет, а не в желтый, как полагается. Если промывать в воде слишком долго, фуксин смывается полностью. Пикриновая кислота смывается в спирте, поэтому обезвоживать нужно быстро. В результате окрашивания ядра клеток должны быть темно-коричневыми (или темно-фиолетовыми при окрашивании гематоксилином Эрлиха), коллагеновые волокна – красными, мышечная ткань, цитоплазма различных клеток и эритроциты – желтыми.
Вопросы для самопроверки
- Определение гистологии как науки.
- Объекты исследования гистологии.
- Перечислите основные свойства микроскопического препарата.
- Назовите основные этапы изготовления гистологического препарата.
- Какие группы красителей используют в гистологической практике?
- Чем отличаются временные гистологические препараты от постоянных?
- Объясните принцип работы на микротоме?
- Техника приготовления тотальных препаратов.
- Какие методы исследования применяют в цитологии и гистологии?
- Типы микроскопов.
- Сходства и различия в световой и электронной микроскопии? Разрешающая способность и увеличение.
- Правила пользования и устройство светового биологического микроскопа.
- Правила оформления лабораторной работы.
- Техника приготовления гистологического препарата – окраска гематоксилин и эозином.
- Дайте характеристику и классификацию фиксаторам.
- Назовите наиболее употребительные фиксаторы.
- Назовите оптимальную толщину срезов при использовании заливки в парафин.
- Преимущества и недостатки четырёх способов уплотнения материала: заливка в парафин, заливка в целлоидин, заливка в желатину; замораживание.
- Для каких исследований применяют заливку в поливакс (карбовакс). Сущность этого метода.
- Различные методы окраски гистологических срезов.
- Методы окрашивания для обзорных целей.