Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого или генетически модифицированного организма . В отличие от традиционной селекции , в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования . Примерами применения генной инженерии являются получение новых генетически модифицированных сортов зерновых культур, производство человеческого инсулина путём использования генномодифицированных бактерий, производство эритропоэтина в культуре клеток или новых пород экспериментальных мышей для научных исследований.

Проводятся первые эксперименты по использованию бактерий с перестроенной ДНК для лечения больных .

Основой микробиологической, биосинтетической промышленности является бактериальная клетка. Необходимые для промышленного производства клетки подбираются по определённым признакам, самый главный из которых - способность производить, синтезировать, при этом в максимально возможных количествах, определённое соединение - аминокислоту или антибиотик, стероидный гормон или органическую кислоту. Иногда надо иметь микроорганизм, способный, например, использовать в качестве «пищи» нефть или сточные воды и перерабатывать их в биомассу или даже вполне пригодный для кормовых добавок белок. Иногда нужны организмы, способные развиваться при повышенных температурах или в присутствии веществ, безусловно смертельных для других видов микроорганизмов.

Задача получения таких промышленных штаммов очень важна, для их видоизменения и отбора разработаны многочисленные приёмы активного воздействия на клетку - от обработки сильнодействующими ядами, до радиоактивного облучения. Цель этих приёмов одна - добиться изменения наследственного, генетического аппарата клетки. Их результат - получение многочисленных микробов-мутантов, из сотен и тысяч которых учёные потом стараются отобрать наиболее подходящие для той или иной цели. Создание приёмов химического или радиационного мутагенеза было выдающимся достижением биологии и широко применяется в современной биотехнологии .

Но их возможности ограничиваются природой самих микроорганизмов. Они не способны синтезировать ряд ценных веществ, которые накапливаются в растениях, прежде всего в лекарственных и эфирномасличных. Не могут синтезировать вещества, очень важные для жизнедеятельности животных и человека, ряд ферментов, пептидные гормоны, иммунные белки, интерфероны да и многие более просто устроенные соединения, которые синтезируются в организмах животных и человека. Разумеется, возможности микроорганизмов далеко не исчерпаны. Из всего изобилия микроорганизмов использована наукой, и особенно промышленностью, лишь ничтожная доля. Для целей селекции микроорганизмов большой интерес представляют, например, бактерии анаэробы , способные жить в отсутствие кислорода, фототрофы , использующие энергию света подобно растениям, хемоавтотрофы , термофильные бактерии, способные жить при температуре, как обнаружилось недавно, около 110 °C, и др.

И всё же ограниченность «природного материала» очевидна. Обойти ограничения пытались и пытаются с помощью культур клеток и тканей растений и животных. Это очень важный и перспективный путь, который также реализуется в биотехнологии. За последние несколько десятилетий учёные создали методы, благодаря которым отдельные клетки тканей растения или животного можно заставить расти и размножаться отдельно от организма, как клетки бактерий. Это было важное достижение - полученные культуры клеток используют для экспериментов и для промышленного получения некоторых веществ, которые с помощью бактериальных культур получить невозможно.

Другое направление исследований - удаление из ДНК генов, ненужных для кодирования белков и функционирования организмов и создание на основе таких ДНК искусственных организмов с "усеченным набором" генов. Это позволяет резко повысить устойчивость модифицируемых организмов к вирусам .

История развития и методы

Во второй половине XX века было сделано несколько важных открытий и изобретений, лежащих в основе генной инженерии . Успешно завершились многолетние попытки «прочитать» ту биологическую информацию, которая «записана» в генах. Эта работа была начата английским учёным Фредериком Сенгером и американским учёным Уолтером Гилбертом (Нобелевская премия по химии 1980 года). Как известно, в генах содержится информация-инструкция для синтеза в организме молекул РНК и белков, в том числе ферментов. Чтобы заставить клетку синтезировать новые, необычные для неё вещества, надо чтобы в ней синтезировались соответствующие наборы ферментов. А для этого необходимо или целенаправленно изменить находящиеся в ней гены, или ввести в неё новые, ранее отсутствовавшие гены. Изменения генов в живых клетках - это мутации. Они происходят под действием, например, мутагенов - химических ядов или излучений. Но такие изменения нельзя контролировать или направлять. Поэтому учёные сосредоточили усилия на попытках разработать методы введения в клетку новых, совершенно определённых генов, нужных человеку.

Все методы генетической инженерии (англ. Genetic engineering techniques ) применяются для осуществления одного из следующих этапов решения генно-инженерной задачи:

1. Получение изолированного гена.
2. Введение гена в вектор для переноса в организм.
3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм.
4. Преобразование клеток организма.
5. Отбор генетически модифицированных организмов (ГМО ) и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.

Процесс синтеза генов в настоящее время разработан очень хорошо и даже в значительной степени автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых закладывают программы синтеза различных нуклеотидных последовательностей. Такой аппарат синтезирует отрезки ДНК длиной до 100-120 азотистых оснований (олигонуклеотиды). Получила распространение техника, позволяющая использовать для синтеза ДНК, в том числе мутантной, полимеразную цепную реакцию . Термостабильный фермент, ДНК-полимераза, используется в ней для матричного синтеза ДНК, в качестве затравки которого применяют искусственно синтезированные кусочки нуклеиновой кислоты - олигонуклеотиды . Фермент обратная транскриптаза позволяет с использованием таких затравок (праймеров) синтезировать ДНК на матрице выделенной из клеток РНК. Синтезированная таким способом ДНК называется комплементарной (РНК) или кДНК. Изолированный, «химически чистый» ген может быть также получен из фаговой библиотеки. Так называется препарат бактериофага , в геном которого встроены случайные фрагменты из генома или кДНК, воспроизводимые фагом вместе со всей своей ДНК.

Техника введения генов в бактерии была разработана после того, как Фредерик Гриффит открыл явление бактериальной трансформации . В основе этого явления лежит примитивный половой процесс, который у бактерий сопровождается обменом небольшими фрагментами нехромосомной ДНК, плазмидами . Плазмидные технологии легли в основу введения искусственных генов в бактериальные клетки.

Значительные трудности были связаны с введением готового гена в наследственный аппарат клеток растений и животных. Однако в природе наблюдаются случаи, когда чужеродная ДНК (вируса или бактериофага) включается в генетический аппарат клетки и с помощью её обменных механизмов начинает синтезировать «свой» белок. Учёные исследовали особенности внедрения чужеродной ДНК и использовали как принцип введения генетического материала в клетку. Такой процесс получил название трансфекция .

Если модификации подвергаются одноклеточные организмы или культуры клеток многоклеточных, то на этом этапе начинается клонирование , то есть отбор тех организмов и их потомков (клонов), которые подверглись модификации. Когда же поставлена задача получить многоклеточные организмы, то клетки с изменённым генотипом используют для вегетативного размножения растений или вводят в бластоцисты суррогатной матери, когда речь идёт о животных. В результате рождаются детеныши с изменённым или неизменным генотипом, среди которых отбирают и скрещивают между собой только те, которые проявляют ожидаемые изменения.

Применение в научных исследованиях

Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия. Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.

Однако возможность внесения более значительных изменений в геном человека сталкивается с рядом серьёзных этических проблем . В 2016 в США группа учёных получила одобрение на клинические испытания метода лечения рака с помощью собственных иммунных клеток пациента, подвергаемых генной модификации с применением технологии CRISPR /Cas9 .

В конце 2018 года в Китае родились двое детей , геном которых был искусственно изменён (выключен ген CCR5) на стадии эмбриона методом CRISPR/Cas9, в рамках исследований, проводимых с 2016 года по борьбе с ВИЧ Один из родителей (отец) был ВИЧ-инфицированным, а дети, по заявлению, родились здоровыми . Поскольку эксперимент был несанкционированным (до этого все подобные эксперименты на человеческом эмбрионе разрешались только на ранних стадиях развития с последующим уничтожением экспериментального материала, то есть без имплантации эмбриона в матку и рождением детей), ответственный за него учёный не предоставил доказательств своим заявлениям, которые были сделаны на международной конференции по редактированию генома. В конце января 2019 года властями Китая были официально подтверждены факты проведения данного эксперимента . Тем временем учёному было запрещено заниматься научной деятельностью и он был арестован .

Клеточная инженерия

Клеточная инженерия основана на культивировании растительных и животных клеток и тканей, способных вне организма производить нужные для человека вещества. Этот метод используется для клонального (бесполого) размножения ценных форм растений; для получения гибридных клеток, совмещающих свойства, например, лимфоцитов крови и опухолевых клеток, что позволяет быстро получить антитела.

Генетическая инженерия в России

Отмечается, что после введения государственной регистрации ГМО заметно возросла активность некоторых общественных организаций и отдельных депутатов Государственной думы, пытающихся воспрепятствовать внедрению инновационных биотехнологий в российское сельское хозяйство. Более 350 российских ученых подписали открытое письмо Общества научных работников в поддержку развития генной инженерии в Российской Федерации. В открытом письме отмечается, что запрет ГМО в России нанесёт не только ущерб здоровой конкуренции на рынке сельскохозяйственной продукции, но приведёт к значительному отставанию в сфере технологий производства пищевых продуктов, усилению зависимости от импорта продуктов питания, и подорвет престиж России, как государства, в котором официально заявлен курс на инновационное развитие [значимость факта? ] .

См. также

Примечания

1. Александр Панчин Обыгрывая бога // Популярная механика . - 2017. - № 3. - С. 32-35. - URL: http://www.popmech.ru/magazine/2017/173-issue/
2. Ольга Волкова. 12 методов в картинках: генная инженерия. Часть I, историческая (рус.) . Биомолекула. Проверено 25 марта 2019.
3. Майкл Вальдхольц Трансформеры // В мире науки . - 2017. - № 5-6. - С. 126 - 135.
4. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system (англ.) . Nature . Проверено 10 января 2017.
5. Элементы - новости науки: Обезьян вылечили от дальтонизма при помощи генной терапии (неопр.) (18 сентября 2009). Проверено 10 января 2017.
6. Трансгенные обезьяны дали первое потомство (неопр.) . membrana (29 мая 2009). Проверено 10 января 2017.
7. Genetically altered babies born (неопр.) . Би-би-си . Проверено 26 апреля 2008. Архивировано 22 августа 2011 года.
8. B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, 2008. «Molecular biology of the cell», 5th ed., Garland Science, USA, pp. 1302-1303
9. Kimmelman J. (2009) «Ethics of cancer gene transfer clinical research», Methods in Molecular Biology 542, 423-445
10. Wagner AM, Schoeberlein A, Surbek D. (2009) «Fetal gene therapy: opportunities and risks», Advanced Drug Delivery Reviews 61, 813-821
11. Gatzidou E, Gatzidou G, Theocharis SE. (2009) «Genetically transformed world records: a reality or in the sphere of fantasy?», Medical Science Monitor 15, RA41-47
12. Lowenstein PR. (2008) «Clinical trials in gene therapy: ethics of informed consent and the future of experimental medicine», Current Opinion in Molecular Therapy 10, 428-430

11 Июля 2008

Генная инженерия (генетическая инженерия) – совокупность методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы .

Генная инженерия – составная часть современной биотехнологии, теоретической основой ее является молекулярная биология, генетика. Суть новой технологии заключается в направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма (in vitro) с последующим внедрением созданных конструкций в живой организм. В результате достигается их включение и активность в данном организме и у его потомства. Возможности генной инженерии – генетическая трансформация, перенос чужеродных генов и других материальных носителей наследственности в клетки растений, животных и микроорганизмов, получение генно-инженерно-модифицированных (генетически модифицированных, трансгенных) организмов с новыми уникальными генетическими, биохимическими и физиологическими свойствами и признаками, делают это направление стратегическим.

С точки зрения методологии генная инженерия сочетает в себе фундаментальные принципы (генетика, клеточная теория, молекулярная биология, системная биология), достижения самых современных постгеномных наук: геномики, метаболомики, протеомики с реальными достижениями в прикладных направлениях: биомедицина, агробиотехнология, биоэнергетика, биофармакология, биоиндустрия и т.д.

Генная инженерия относится (наряду с биотехнологией, генетикой, молекулярной биологией, и рядом других наук о жизни) к сфере естественных наук.

Историческая справка

Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. В 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК, на рубеже 50 – 60-х годов 20 века были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали E.coli, ее вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 1970 году Г.Смитом был впервые выделен ряд ферментов – рестриктаз, пригодных для генно-инженерных целей. Г.Смит установил, что полученный из бактерий очищенный фермент HindII сохраняет способность разрезать молекулы нуклеиновых кислот (нуклеазная активность), характерную для живых бактерий. Комбинирование ДНК-рестриктаз (для разрезания молекул ДНК на определенные фрагменты) и выделенных еще в 1967 г. ферментов – ДНК-лигаз (для «сшивания» фрагментов в произвольной последовательности) по праву можно считать центральным звеном в технологии генной инженерии.

Таким образом, к началу 70-х годов были сформулированы основные принципы функционирования нуклеиновых кислот и белков в живом организме и созданы теоретические предпосылки генной инженерии

Академик А.А. Баев был первым в нашей стране ученым, который поверил в перспективность генной инженерии и возглавил исследования в этой области. Генетическая инженерия (по его определению) – конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе – создание искусственных генетических программ.

Задачи и методы генной инженерии

Хорошо известно, что традиционная селекция имеет целый ряд ограничений, которые препятствуют получению новых пород животных, сортов растений или рас практически ценных микроорганизмов:

1. отсутствие рекомбинации у неродственных видов. Между видами существуют жесткие барьеры, затрудняющие естественную рекомбинацию.
2. невозможность управлять процессом рекомбинации в организме извне. Отсутствие гомологии между хромосомами приводит к неспособности сближаться и обмениваться отдельными участками (и генами) в процессе образования половых клеток. В результате становится невозможным перенос нужных генов и обеспечение оптимального сочетания в новом организме генов, полученных от разных родительских форм;
3. невозможность точно задать признаки и свойства потомства, т.к. процесс рекомбинации – статистический.

Природные механизмы, стоящие на страже чистоты и стабильности генома организма, практически невозможно преодолеть методами классической селекции.

Технология получения генетически модифицированных организмов (ГМО) принципиально решает вопросы преодоления всех естественных и межвидовых рекомбинационных и репродуктивных барьеров. В отличие от традиционной селекции, в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования. Генная инженерия позволяет оперировать любыми генами, даже синтезированными искусственно или принадлежащими не родственным организмам, переносить их от одного вида к другому, комбинировать в произвольном порядке.

Технология включает несколько этапов создания ГМО:

1. Получение изолированного гена.
2. Введение гена в вектор для встраивания в организм.
3. Перенос вектора с конструкцией в модифицируемый организм-рецепиент.
4. Молекулярное клонирование.
5. Отбор ГМО.

Первый этап – синтез, выделение и идентификация целевых фрагментов ДНК или РНК и регуляторных элементов очень хорошо разработан и автоматизирован. Изолированный ген может быть также получен из фаговой библиотеки.

Второй этап – создание in vitro (в пробирке) генетической конструкции (трансгена), которая содержит один или несколько фрагментов ДНК (кодирующих последовательность аминокислот белков) в совокупности с регуляторными элементами (последние обеспечивают активность трансгенов в организме). Далее трансгены встраивают в ДНК вектора для клонирования, используя инструментарий генной инженерии – рестриктазы и лигазы. За открытие рестриктаз Вернер Арбер, Даниел Натанс и Хамилтон Смит были удостоены Нобелевской премии (1978 г.). Как правило, в качестве вектора используют плазмиды – небольшие кольцевые молекулы ДНК бактериального происхождения.

Следующий этап – собственно «генетическая модификация» (трансформация), т.е. перенос конструкции «вектор – встроенная ДНК» в отдельные живые клетки. Введение готового гена в наследственный аппарат клеток растений и животных представляет собой сложную задачу, которая была решена после изучения особенностей внедрения чужеродной ДНК (вируса или бактерии) в генетический аппарат клетки. Процесс трансфекции был использован как принцип введения генетического материала в клетку.

Если трансформация прошла успешно, то после эффективной репликации из одной трансформированной клетки возникает множество дочерних клеток, содержащих искусственно созданную генетическую конструкцию. Основой для появления у организма нового признака служит биосинтез новых для организма белков – продуктов трансгена, например, растений – устойчивости к засухе или насекомым-вредителям у ГМ растений.

Для одноклеточных организмов процесс генетической модификации ограничивается встраиванием рекомбинантной плазмиды с последующим отбором модифицированных потомков (клонов). Для высших многоклеточных организмов, например, растений, то обязательным является включение конструкции в ДНК хромосом или клеточных органелл (хлоропластов, митохондрий) с последующей регенерацией целого растения из отдельной изолированной клетки на питательных средах. В случае животных, клетки с измененным генотипом вводят в бластоциды суррогатной матери. Первые ГМ растения были получены в 1982 году учеными из Института растениеводства в Кельне и компании Monsanto.

Основные направления

Постгеномная эра в первой декаде XXI-ого века подняла на новый уровень развитие генной инженерии. Так называемый Кельнский Протокол «На пути к биоэкономике, основанной на знаниях» , определил биоэкономику как «преобразование знаний наук о жизни в новую, устойчивую, экологически эффективную и конкурентоспособную продукцию». Дорожная карта генной инженерии содержит целый ряд направлений: генотерапия, биоиндустрия, технологии, основанные на стволовых клетках животных, ГМ растения, ГМ животные и т.д.

Генетически модифицированные растения

Ввести чужеродную ДНК в растения можно различными способами.

Для двудольных растений существует естественный вектор для горизонтального переноса генов: плазмиды агробактерий. Что касается однодольных, то, хотя в последние годы достигнуты определенные успехи в их трансформации агробактериальными векторами, все же подобный путь трансформации встречает существенные затруднения.

Для трансформации устойчивых к агробактериям растений разработаны приемы прямого физического переноса ДНК в клетку они включают: бомбардировку микрочастицами или баллистический метод; электропорацию; обработку полиэтиленгликолем; перенос ДНК в составе липосом и др.

После проведения тем или иным способом трансформации растительной ткани ее помещают in vitro на специальную среду с фитогормонами, способствующую размножению клеток. Среда обычно содержит селективный агент, в отношении которого трансгенные, но не контрольные клетки приобретают устойчивость. Регенерация чаще всего проходит через стадию каллуса, после чего при правильном подборе сред начинается органогенез (побегообразование). Сформированные побеги переносят на среду укоренения, часто также содержащую селективный агент для более строгого отбора трансгенных особей.

Первые трансгенные растения (растения табака со встроенными генами из микроорганизмов) были получены в 1983 г. Первые успешные полевые испытания трансгенных растений (устойчивые к вирусной инфекции растения табака) были проведены в США уже в 1986 г.

После прохождения всех необходимых тестов на токсичность, аллергенность, мутагенность и т.д. первые трансгенные продукты появились в продаже в США в 1994 г. Это были томаты Flavr Savr с замедленным созреванием, созданные фирмой «Calgen», а также гербицид-устойчивая соя компании «Monsanto». Уже через 1-2 года биотехнологические фирмы поставили на рынок целый ряд генетически измененных растений: томатов, кукурузы, картофеля, табака, сои, рапса, кабачков, редиса, хлопчатника.

В РФ возможность получения трансгенного картофеля методом бактериальной трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens была показана в 1990 г.

В настоящее время получением и испытанием генетически модифицированных растений занимаются сотни коммерческих фирм во всем мире с совокупным капиталом более 100 миллиардов долларов. Генно-инженерная биотехнология растений уже стала важной отраслью производства продовольствия и других полезных продуктов, привлекающей значительные людские ресурсы и финансовые потоки.

В России под руководством академика К.Г. Скрябина (Центр «Биоинженерия» РАН) получены и охарактеризованы ГМ сорта картофеля Елизавета плюс и Луговской плюс, устойчивые к колорадскому жуку. По результатам проверки Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека на основании экспертного заключения ГУ НИИ питания РАМН данные сорта прошли государственную регистрацию, внесены в государственный реестр и разрешены для ввоза, изготовления и оборота на территории РФ.

Данные ГМ сорта картофеля принципиально отличается от обычных наличием в его геноме встроенного гена, определяющего 100%-ю защиту урожая от колорадского жука без использования каких-либо химических средств.

Первая волна трансгенных растений, допущенных для практического применения, содержала дополнительные гены устойчивости (к болезням, гербицидам, вредителям, порче при хранении, стрессам).

Нынешний этап развития генетической инженерии растений получил название «метаболическая инженерия». При этом ставится задача не столько улучшить те или иные имеющиеся качества растения, как при традиционной селекции, сколько научить растение производить совершенно новые соединения, используемые в медицине, химическом производстве и других областях. Этими соединениями могут быть, например, особые жирные кислоты, полезные белки с высоким содержанием незаменимых аминокислот, модифицированные полисахариды, съедобные вакцины, антитела, интерфероны и другие «лекарственные» белки, новые полимеры, не засоряющие окружающую среду и многое, многое другое. Использование трансгенных растений позволяет наладить масштабное и дешевое производство таких веществ и тем самым сделать их более доступными для широкого потребления.

Генетически модифицированные животные

Клетки животных существенно отличаются от бактериальных по своей способности поглощать чужеродную ДНК, поэтому методы и способы способы введения генов в эмбриональные клетки млекопитающих, мух и рыб остаются в центре внимания генных инженеров.

Наиболее изученное в генетическом отношении млекопитающее – мыши. Первый успех относится к 1980 году, когда Д. Гордон с сотрудниками продемонстрировал возможность введения и интеграции чужеродной ДНК в геном мышей. Интеграция была стабильной и сохранялась у потомства. Трансформацию производят микроинъекцией клонированных генов в один или оба пронуклеуса (ядра) только что эмбриона на стадии одной клетки (зиготы). Чаще выбирают мужской пронуклеус, привнесенный сперматозоидом, так как его размеры больше. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной матери, или дают возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку.

Таким образом были инъецированы гены интерферона и инсулина человека, ген β-глобина кролика, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей. Число молекул, вводимое за одну инъекцию, колеблется от 100 до 300 000, а их размер – от 5 до 50 кб. Выживает обычно 10 – 30% яйцеклеток, а доля мышей, родившихся из трансформированных яйцеклеток варьирует от нескольких до 40%. Таким образом, реальная эффективность составляет около 10%.

Таким методом получены генно-инженерные крысы, кролики, овцы, свиньи, козы, телята и другие млекопитающие. В нашей стране получены свиньи, несущие ген соматотропина. Они не отличались по темпам роста от нормальных животных, но изменение обмена веществ сказалось на содержании жира. У таких животных ингибировались процессы липогенеза и активировался синтез белка. К изменению обмена веществ приводило и встраивание генов инсулиноподобного фактора. ГМ свиньи были созданы для изучения цепочки биохимических превращений гормона, а побочным эффектом явилось укрепление иммунной системы.

Самая мощная белоксинтезирующая система находится в клетках молочной железы. Если поставить гены чужих белков под контроль казеинового промотора, то экспрессия этих генов будет мощной и стабильной, а белок будет накапливаться в молоке. С помощью животных-биореакторов (трансгенные коровы) уже получено молоко, в котором содержится человеческий белок лактоферрин. Этот белок планируется применять для профилактики гастроэнтерологических заболеваний у людей с низкой иммунорезистентностью: больные СПИДом, недоношенные младенцы, больные раком, прошедшие радиотерапию.

Важное направление трансгеноза – получение устойчивых к болезням животных. Ген интерферона, относящийся к защитным белкам, встраивали различным животным. Трансгенные мыши получили устойчивость – они не болели или болели мало, а вот у свиней такого эффекта не обнаружено.

Применение в научных исследованиях

Нокаут гена (gene knockout) – техника удаления одного или большего количества генов, что позволяет исследовать функции гена. Для получения нокаутных мышей полученную генно-инженерную конструкцию вводят в эмбриональные стволовые клетки, где конструкция подвергается соматической рекомбинации и замещает нормальный ген, а измененные клетки имплантируют в бластоцист суррогатной матери. Сходным способом получают нокаут у растений и микроорганизмов.

Искусственная экспрессия – добавление в организм гена, которого у него ранее не было, также с целями изучения функции генов. Визуализация продуктов генов – используется для изучения локализации продукта гена. Замещение нормального гена на сконструрованный ген, слитый с репортёрным элементом, (например, с геном зелёного флуоресцентного белка) обеспечивает визуализацию продукта генной модификации.

Исследование механизма экспрессии. Небольшой участок ДНК, расположенный перед кодирующей областью (промотор) и служащий для связывания факторов транскрипции, вводят в организм, поставив после него вместо собственного гена репортерный, например, GFP, катализирующий легко обнаруживаемую реакцию. Кроме того, что функционирование промотора в тех или иных тканях в тот или иной момент становится хорошо заметным, такие эксперименты позволяют исследовать структуру промотора, убирая или добавляя к нему фрагменты ДНК, а также искусственно усиливать экспрессию генов.

Биобезопасность генно-инженерной деятельности

Еще в 1975 г. ученые всего мира на Асиломарской конференции подняли важнейший вопрос: не окажет ли появление ГМО потенциально негативного воздействия на биологическое разнообразие? С этого момента одновременно с бурным развитием генной инженерии стало развиваться новое направление - биобезопасность. Главная ее задача - оценить не несет ли использование ГМО нежелательное воздействие на окружающую среду, здоровье человека и животных, а главная цель - открыть путь к использованию достижений современной биотехнологии, гарантируя при этом безопасность.

Стратегия биобезопасности основывается на научном исследовании особенностей ГМО, опыте обращения с ним, а также информации о его предполагаемом использовании и окружающей среде, в которую он будет интродуцирован. Совместными многолетними усилиями международных организаций (ЮНЕП, ВОЗ, ОЭСР), экспертов из разных стран, в т. ч. России, были разработаны базовые понятия и процедуры: биологическая безопасность, биологическая опасность, риск, оценка рисков. Только после того, как полный цикл проверок будет успешно осуществлен, готовится научное заключение о биобезопасности ГМО. В 2005 г. ВОЗ опубликовало доклад, согласно которому употребление зарегистрированных в качестве пищи ГМ растений также безопасно, как их традиционных аналогов.

Как обеспечивается биобезопасность в России? Началом включения России в мировую систему биобезопасности можно считать ратификацию «Конвенции о биоразнообразии» в 1995 году. С этого момента началось формирование национальной системы биобезопасности, отправной точкой которой явилось вступление в силу Федерального закона РФ «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности» (1996 г.). ФЗ устанавливает основные понятия и принципы государственного регулирования и контроля всех видов работ с ГМО. ФЗ устанавливает уровни риска в зависимости от типа ГМО и вида работ, дает определения замкнутой и открытой систем, выпуска ГМО и т.д.

За прошедшие годы в России сформировалась одна из самых жестких систем регулирования. Неординарен тот факт, что система государственного регулирования ГМО стартовала превентивно, в 1996 году, до того, как реальные генно-инженерные организмы были заявлены для коммерциализации на территории России (первый ГМО – ГМ соя - была зарегистрирована для пищевого использования в 1999г.). Базовыми правовыми инструментами служат государственная регистрация генно-инженерно-модифицированных организмов, а также продукции, полученной из них или их содержащей, предназначенных для использования в качестве пищи и кормов.

Для понимания современной ситуации важен факт, что в течение 25 лет, прошедших с момента первого выхода ГМ растений на рынок, не было выявлено ни одного достоверного отрицательного воздействия их на окружающую среду и здоровье человека и животных ни в ходе испытаний, ни при коммерческом использовании. Только в одном из мировых источников – отчете авторитетного общества AGBIOS «Essential Biosafety» содержится более 1000 ссылок на исследования, доказывающие, что пища и корма, полученные из биотехнологических культур, настолько же безопасны, насколько безопасны и традиционные продукты. Однако на сегодняшний день в России отсутствует нормативно-правовая база, которая позволила бы осуществлять на территории нашей страны выпуск в окружающую среду ГМ растений, а также продукции, полученной из них или их содержащей. Как следствие – на 2010 год ни одно ГМ растение не выращивается на территории Российской Федерации в коммерческих целях.

По прогнозу, согласно Кельнскому Протоколу (2007 г), к 2030 г. отношение к сельскохозяйственным ГМ культурам изменится в сторону одобрения их использования.

Достижения и перспективы развития

Генная инженерия в медицине

Потребности здравоохранения, необходимость решения проблем старения населения формируют устойчивый спрос на генно-инженерные фармпрепараты (с годовым объемом продаж в 26 млрд. долл. США) и лечебно-косметические средства из растительного и животного сырья (с годовым объемом продаж около 40 млрд. долл. США).

Среди многих достижений генной инженерии, получивших применение в медицине, наиболее значительное – получение человеческого инсулина в промышленных масштабах.

В настоящее время по данным ВОЗ в мире насчитывается около 110 млн. людей, страдающих диабетом. Инсулин, инъекции которого показаны больным этим заболеванием, уже давно получают из органов животных и используют в медицинской практике. Однако многолетнее применение животного инсулина ведет к необратимому поражению многих органов пациента из-за иммунологических реакций, вызываемых инъекцией чужеродного человеческому организму животного инсулина. Но даже потребности в животном инсулине до недавнего времени удовлетворялись всего на 60 – 70%. Генные инженеры в качестве первой практической задачи клонировали ген инсулина. Клонированные гены человеческого инсулина были введены с плазмидой в бактериальную клетку, где начался синтез гормона, который природные микробные штаммы никогда не синтезировали. Начиная с 1982 года фирмы США, Японии, Великобритании и других стран производят генно-инженерный инсулин. В России получение генно-инженерного человеческого инсулина – Инсурана ведется в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Сегодня отечественный инсулин производится в объеме, достаточном для обеспечения больных диабетом г. Москвы. Вместе с тем, потребность всего российского рынка в генно-инженерном инсулине удовлетворяется, в основном, импортными поставками. Мировой рынок инсулина составляет в настоящее время более 400 млн. долларов, ежегодное потребление около 2500 кг.

Развитие генной инженерии в 80-х годах прошлого столетия обеспечило хороший задел России в создании генно-инженерных штаммов микроорганизмов с заданными свойствами – продуцентов биологически активных веществ, в разработке генно-инженерных методов реконструирования генетического материала вирусов, в получении лекарственных субстанций, в том числе и с использованием компьютерного моделирования. До стадии производства доведены рекомбинантный интерферон и лекарственные формы на его основе медицинского и ветеринарного назначения, интерлейкин (b-лейкин), эритропоэтин. Несмотря на растущий спрос на высокоочищенные препараты, отечественное производство иммуноглобулинов, альбумина, плазмола обеспечивает 20% потребностей внутреннего рынка.

Активно ведутся исследования по разработке вакцин для профилактики и лечения гепатитов, СПИДа и ряда других заболеваний, а также конъюгированных вакцин нового поколения против наиболее социально значимых инфекций. Полимер-субъединичные вакцины нового поколения состоят из высокоочищенных протективных антигенов различной природы и носителя – иммуностимулятора полиоксидония, обеспечивающего повышенный уровень специфического иммунного ответа. Прививки против подавляющего большинства известных инфекций Россия могла бы обеспечить на базе собственного иммунологического производства. Полностью отсутствует только производство вакцины против краснухи.

Генная инженерия для сельского хозяйства

Генетическое улучшение сельскохозяйственных культур и декоративных растений представляет собой длительный и непрерывный процесс с использованием все более точных и предсказуемых технологий. В научном отчете ООН (за 1989 год) сказано следующее: «Поскольку молекулярные методы наиболее точны, те, кто их применяет, в большей степени уверены в том, какими признаками они наделяют растения, и, следовательно, реже получают незапланированные эффекты, чем при использовании обычных методов селекции.»

Преимущества новых технологий уже широко используются в таких странах, как США, Аргентина, Индия, Китай и Бразилия, где генетически модифицированные культуры возделывают на больших территориях.

Новые технологии также имеют большое значение для малоимущих фермеров и жителей бедных стран, особенно женщин и детей. Например, генетически модифицированные, устойчивые к вредителям, хлопчатник и кукуруза требуют применения инсектицидов в значительно меньших объемах (что делает труд на ферме более безопасным). Такие культуры способствуют повышению урожайности, получению фермерами более высоких доходов, снижению уровня бедности и риска отравления населения химическими пестицидами, что особенно характерно для ряда стран, в том числе для Индии, Китая, ЮАР и Филиппин.

Самыми распространенными ГМ растениями являются культуры, устойчивые к недорогим, наименее токсичным и наиболее широко используемым гербицидам. Возделывание таких культур позволяет получать более высокий урожай с гектара, избавиться от изнурительной ручной прополки, тратить меньше средств за счет минимальной или беспахотной обработки земли, что, в свою очередь, приводит к снижению эрозии почвы.

В 2009 году произошла замена генетически модифицированных культур первого поколения продуктами второго поколения, что впервые привело к увеличению урожайности per se. Пример биотехнологической культуры нового класса (над созданием которой работали многие исследователи) – устойчивая к глифосату соя RReady2Yield™ , выращивалась в 2009 году в США и Канаде более чем на 0.5 миллионах га.

Внедрение генной инженерии в современную агробиологию может быть проиллюстрировано следующими фактами из ряда зарубежных экспертных обзоров, в том числе, из ежегодного обзора независимой Международной службы по мониторингу за применением агробиотехнологий (ISAАA), возглавляемой известным в мире экспертом Клайвом Джеймсом (Claiv James): (www.isaaa.org)

В 2009 году в 25 странах мира выращивали ГМ культуры на площади 134 млн. га (что составляет 9% от 1,5 млрд. га всех пахотных земель в мире). Шесть стран ЕС (из 27) возделывали Bt кукурузу, и в 2009 году площади ее посевов достигли более 94 750 га. Анализ мирового экономического эффекта использования биотехнологических культур за период с 1996 по 2008 г.г. показывает рост прибыли в размере 51,9 миллиардов долларов благодаря двум источникам: во-первых, это сокращение производственных затрат (50%) и, во-вторых, значительная прибавка урожая (50%) в размере 167 миллионов тонн.

В 2009 году общая рыночная стоимость семян ГМ культур в мире составила 10.5 миллиардов долларов. Общая стоимость по зерну биотех кукурузы и сои, а также хлопчатника в 2008 году составила 130 млрд. долларов, и ожидается, что ее ежегодный рост составит 10 – 15%.

Подсчитано, что в случае полного принятия биотехнологии, к концу периода 2006 – 2015 г. прибыль всех стран в пересчете на ВВП вырастет на 210 млрд. долл. США в год.

Наблюдения, проводимые с начала применения в сельском хозяйстве устойчивых к гербицидам сельскохозяйственных культур, убедительно доказывают, что фермеры получили возможность более эффективно бороться с сорняками. При этом рыхление и распахивание полей утрачивают свое значение как средства борьбы с сорняками. В итоге снижается расход тракторного топлива, улучшается структура почвы и предотвращается ее эрозия. Целевые инсектицидные программы выращивания Bt хлопчатника предусматривают меньшее число опрыскиваний посевов и, следовательно, меньшее количество выездов техники на поля, что приводит к сокращению эрозии почв. Все это невольно содействует внедрению консервирующей технологии обработки почвы, направленной на снижение почвенной эрозии, уровня углекислого газа и уменьшения потери воды.

Для современного состояния науки характерен комплексный подход, создание единых технологических платформ для проведения широкого спектра исследований. Они объединяют не только биотехнологию, молекулярную биологию и генную инженерию, но также и химию, физику, биоинформатику, транскриптомику, протеомику, метаболомику.

Рекомендуемая литература
1. Дж. Уотсон. Молекулярная биология гена. М.: Мир. 1978.
2. Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. М.: Мир. 1981
3. С.Н. Щелкунов «Генетическая инженерия». Новосибирск, издательство Сибирского Университета, 2008
4. Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. М.: Мир, 2002
5. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. Под редакцией Дж. Дрейпера, Р.Скотта, Ф. Армитиджа, Р. Уолдена. М.: «Мир». 1991.
6. Агробиотехнология в мире. Под ред. Скрябина К.Г. М.: Центр «Биоинженерия» РАН, 2008. – 135 с.
7. Кларк. Д., Рассел Л. Молекулярная биология простой и занимательный подход. М.: ЗАО «Компания КОНД». 2004

Ссылки
1. «О государственном регулировании генно-инженерной деятельности». ФЗ-86 в ред. 2000 г., ст.1
2. Кельнский Протокол, Cologne Paper, принят на конференции «На пути к Биоэкономике, основанной на знаниях» (Кельн, 30 мая 2007 г.), организованной Европейским Союзом в период президентства Германии в ЕС.

Экономическое значение

Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого или генетически модифицированного организма . В отличие от традиционной селекции , в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования . Примерами применения генной инженерии являются получение новых генетически модифицированных сортов зерновых культур, производство человеческого инсулина путём использования генномодифицированных бактерий, производство эритропоэтина в культуре клеток или новых пород экспериментальных мышей для научных исследований.

Основой микробиологической, биосинтетической промышленности является бактериальная клетка. Необходимые для промышленного производства клетки подбираются по определённым признакам, самый главный из которых - способность производить, синтезировать, при этом в максимально возможных количествах, определённое соединение - аминокислоту или антибиотик, стероидный гормон или органическую кислоту. Иногда надо иметь микроорганизм, способный, например, использовать в качестве «пищи» нефть или сточные воды и перерабатывать их в биомассу или даже вполне пригодный для кормовых добавок белок. Иногда нужны организмы, способные развиваться при повышенных температурах или в присутствии веществ, безусловно смертельных для других видов микроорганизмов.

Задача получения таких промышленных штаммов очень важна, для их видоизменения и отбора разработаны многочисленные приёмы активного воздействия на клетку - от обработки сильнодействующими ядами, до радиоактивного облучения. Цель этих приёмов одна - добиться изменения наследственного, генетического аппарата клетки. Их результат - получение многочисленных микробов-мутантов, из сотен и тысяч которых учёные потом стараются отобрать наиболее подходящие для той или иной цели. Создание приёмов химического или радиационного мутагенеза было выдающимся достижением биологии и широко применяется в современной биотехнологии .

Но их возможности ограничиваются природой самих микроорганизмов. Они не способны синтезировать ряд ценных веществ, которые накапливаются в растениях, прежде всего в лекарственных и эфирномасличных. Не могут синтезировать вещества, очень важные для жизнедеятельности животных и человека, ряд ферментов, пептидные гормоны, иммунные белки, интерфероны да и многие более просто устроенные соединения, которые синтезируются в организмах животных и человека. Разумеется, возможности микроорганизмов далеко не исчерпаны. Из всего изобилия микроорганизмов использована наукой, и особенно промышленностью, лишь ничтожная доля. Для целей селекции микроорганизмов большой интерес представляют, например, бактерии анаэробы , способные жить в отсутствие кислорода, фототрофы, использующие энергию света подобно растениям, хемоавтотрофы, термофильные бактерии, способные жить при температуре, как обнаружилось недавно, около 110 °C, и др.

И всё же ограниченность «природного материала» очевидна. Обойти ограничения пытались и пытаются с помощью культур клеток и тканей растений и животных. Это очень важный и перспективный путь, который также реализуется в биотехнологии . За последние несколько десятилетий учёные создали методы, благодаря которым отдельные клетки тканей растения или животного можно заставить расти и размножаться отдельно от организма, как клетки бактерий. Это было важное достижение - полученные культуры клеток используют для экспериментов и для промышленного получения некоторых веществ, которые с помощью бактериальных культур получить невозможно.

История развития и достигнутый уровень технологии

Во второй половине XX века было сделано несколько важных открытий и изобретений, лежащих в основе генной инженерии . Успешно завершились многолетние попытки «прочитать» ту биологическую информацию, которая «записана» в генах. Эта работа была начата английским учёным Ф. Сенгером и американским учёным У. Гилбертом (Нобелевская премия по химии г.). Как известно, в генах содержится информация-инструкция для синтеза в организме молекул РНК и белков, в том числе ферментов. Чтобы заставить клетку синтезировать новые, необычные для неё вещества, надо чтобы в ней синтезировались соответствующие наборы ферментов. А для этого необходимо или целенаправленно изменить находящиеся в ней гены, или ввести в неё новые, ранее отсутствовавшие гены. Изменения генов в живых клетках - это мутации. Они происходят под действием, например, мутагенов - химических ядов или излучений. Но такие изменения нельзя контролировать или направлять. Поэтому учёные сосредоточили усилия на попытках разработать методы введения в клетку новых, совершенно определённых генов, нужных человеку.

Основные этапы решения генноинженерной задачи следующие:

1. Получение изолированного гена. 2. Введение гена в вектор для переноса в организм. 3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм. 4. Преобразование клеток организма. 5. Отбор генетически модифицированных организмов (ГМО ) и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.

Процесс синтеза генов в настоящее время разработан очень хорошо и даже в значительной степени автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых закладывают программы синтеза различных нуклеотидных последовательностей. Такой аппарат синтезирует отрезки ДНК длиной до 100-120 азотистых оснований (олигонуклеотиды). Получила распространение техника, позволяющая использовать для синтеза ДНК , в том числе мутантной, полимеразную цепную реакцию . Термостабильный фермент, ДНК-полимераза, используется в ней для матричного синтеза ДНК , в качестве затравки которого применяют искусственно синтезированные кусочки нуклеиновой кислоты - олигонуклеотиды. Фермент обратная транскриптаза позволяет с использованием таких затравок (праймеров) синтезировать ДНК на матрице выделенной из клеток РНК . Синтезированная таким способом ДНК называется комплементарной (РНК) или кДНК. Изолированный, «химически чистый» ген может быть также получен из фаговой библиотеки. Так называется препарат бактериофага , в геном которого встроены случайные фрагменты из генома или кДНК, воспроизводимые фагом вместе со всей своей ДНК .

Техника введения генов в бактерии была разработана после того, как Фредерик Гриффит открыл явление бактериальной трансформации . В основе этого явления лежит примитивный половой процесс, который у бактерий сопровождается обменом небольшими фрагментами нехромосомной ДНК , плазмидами . Плазмидные технологии легли в основу введения искусственных генов в бактериальные клетки.

Значительные трудности были связаны с введением готового гена в наследственный аппарат клеток растений и животных. Однако в природе наблюдаются случаи, когда чужеродная ДНК (вируса или бактериофага) включается в генетический аппарат клетки и с помощью её обменных механизмов начинает синтезировать «свой» белок. Учёные исследовали особенности внедрения чужеродной ДНК и использовали как принцип введения генетического материала в клетку. Такой процесс получил название трансфекция .

Если модификации подвергаются одноклеточные организмы или культуры клеток многоклеточных, то на этом этапе начинается клонирование , то есть отбор тех организмов и их потомков (клонов), которые подверглись модификации. Когда же поставлена задача получить многоклеточные организмы, то клетки с изменённым генотипом используют для вегетативного размножения растений или вводят в бластоцисты суррогатной матери, когда речь идёт о животных. В результате рождаются детеныши с изменённым или неизменным генотипом , среди которых отбирают и скрещивают между собой только те, которые проявляют ожидаемые изменения.

Применение в научных исследованиях

Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия. Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.

Однако возможность внесения более значительных изменений в геном человека сталкивается с рядом серьёзных этических проблем

Генетическая (генная) инженерия

Генетическая (генная) инженерия – конструирование искусственным путем генетических структур и наследственно измененных организмов. Генетическая инженерия – раздел (прикладная ветвь) молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием новых молекул ДНК, способных размножаться в клетке-хозяине. При этом происходит искусственное, целенаправленное изменение генотипа организма (микроорганизма) и формирование новых признаков и свойств. Генная инженерия занимается рашифровкой структуры генов, их синтезом и клонированием, вставкой выделенных из клеток живых организмов генов в клетки растений и животных с целью направленного изменения их генетических особенностей.

Хорошо разработанными методами генной инженерии являются трансгенез, микробиологический синтез и др.

Трансгенез – перенос генов от одного вида организмов в другой. Трансгенез осуществляется путем разрезания и сшивания участков ДНК при участии ферментов – рестриктаз и лигаз.

Этапы трансгенеза :

а) выделение генов (фрагментов ДНК) из клеток бактерий, растений или животных с помощью фермента рестриктазы ;

б) соединение (сшивание) генов (фрагментов ДНК) с плазмидой с помощью фермента лигазы ;

в) введение гибридной плазмидной ДНК, содержащей нужный ген в клетку хозяина;

г) копирование (клонирование) этого гена в клетке хозяина и обеспечение его работы по схеме: «Код ДНК – транскрипция – трансляция – белок»

Инструментами генной инженерии являются открытые в 1974 г ферменты – рестриктазы (рестрикционные эндонуклеазы). Рестриктазы узнают участки (сайты) ДНК, вносят разрезы в цепях ДНК. На концах каждого фрагмента образуются одноцепочечные хвосты, называемые «липкими концами», поскольку они могут, как бы слипаться между собой вследствие комплементарности.

Рестриктазы узнают в двухцепочечной ДНК определенную, только свою последовательность нуклеотидов ДНК. Затем рестриктаза прикрепляется к распознаваемому участку нуклеотидов и разрезает его в месте прикрепления. Чаще рестриктазы распознают в молекуле ДНК участки длиной в 4–6 пар нуклеотидов и разрезают обе цепи ДНК посередине этих участков или обычно со смещением. Примеры рестриктаз : рестриктаза Eco RI , которая узнает фрагмент ДНК из шести нуклеотидов ГААТТЦ (место разреза между нуклеотидами Г и А обеих цепей ДНК); рестриктаза Hind III распознает участок ААГЦТТ (место разреза между нуклеотидами А и А обеих цепей ДНК); рестриктаза Bam I распознает участок ГГАТЦЦ (место разреза между нуклеотидами Г и Г обеих цепей ДНК); рестриктаза Hae III распознает участок ГГЦЦ (место разреза между нуклеотидами Г и Ц обеих цепей ДНК); рестриктаза Hpa II распознает участок ЦЦГГ(место разреза между нуклеотидами Ц и Ц обеих цепей ДНК).

Далее для конструирования генетически измененного организма необходимо ввести нужный ген в клетку этого организма. Введение чужеродных генов в организм осуществляется с помощью плазмидного вектора . Вектором является плазмида – маленькая кольцевая молекула ДНК, которую извлекают из цитоплазмы бактериальной клетки. Плазмиды – факторы наследственности, расположенные вне хромосом, представляющие собой внехромосомную ДНК .

Рис . 37.

А – Схема введения чужеродной ДНК в бактериальную плазмиду с использованием ферментов (рестрикционной эндонуклеазы и лигазы).

Б – Схема переноса гена человека, ответственного за синтез гормона инсулина и образование векторной ДНК.

Свойства плазмиды: 1) обладает способностью к автономной репликации; 2) содержит гены, кодирующие антибиотики; 3) способны встраиваться в хромосому клетки-реципиента; 4) распознает участки ДНК, которые могут разрезать ферменты - рестриктазы; 5) рестриктаза может разрезать плазмиду и переводить ее в линейное состояние. Эти свойства плазмиды исследователи используют для получения рекомбинантных (гибридных) ДНК.

Последовательность введения ДНК в плазмиду (плазмидный вектор) с помощью фермента рестриктазы (рис. 37 А):

1) рестрикция – разрезание молекулы ДНК рестриктазой, образование фрагментов ДНК и выделение необходимого гена ;

2) включение выделенного гена в плазмиду , т. е. получение рекомбинантной (гибридной) ДНК путем введения фрагмента чужеродной ДНК в плазмиду;

3) лигирование – сшивание ферментом лигазой плазмидного (векторного) и чужеродного фрагментов ДНК; при этом концы векторной и чужеродной ДНК (т. н. «клейкие концы») комплементарны друг другу;

4) трансформация – введение рекомбинантной плазмиды в геном другой клетки (клетки-реципиента), в частности, бактериальной клетки.

Следует отметить, что плазмиды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Трансформированные бактерии вместе с плазмидами приобретают устойчивость к определенному антибиотику, что позволяет их отделить от нетрансформированных, погибающих на среде, содержащей антибиотик. Каждая из трансформированных бактерий, помещенная на питательную среду, размножается и образует колонию из многих тысяч потомков – клон.

5) скрининг – отбор среди трансформированных бактерий тех, которые содержат плазмиды с нужным геном.

Трансгенные животные и растения

Клонированные гены с помощью микроинъекции вводят в яйцеклетку млекопитающих или протопласты растений (изолированная клетка, лишенная клеточной стенки) и далее из них выращивают животных, или растения, в геноме которых действуют чужеродные гены. Растения и животные, геном которых изменен путем генноинженерных операций, получили название трансгенных организов (трансгенных растений и животных) , поскольку в нем содержатся чужеродные гены. Получены трансгенные мыши, кролики, свиньи, овцы. В их геноме работают гены бактерий, млекопитающих, человека. Получены трансгенные растения (кукуруза, перец, томаты, пшеница, рожь, бобовые, картофель и др.), содержащие гены неродственных видов. Трансгенные растения устойчивы к гербицидам, насекомым, неблагоприятным погным условиям и др. Постепенно решается проблема изменения наследственности многих сельскохозяйственных растений.

Генетическая карта хромосом. Генная терапия

Генетической картой хромосом называют схему взаимного расположения генов, находящихся в одной группе сцепления. Такие карты составляются для каждой пары гомологичных хромосом. На генетической карте указан порядок расположения генов в хромосоме и расстояния между ними (процент кроссинговера между определенными генами). Так создание новых штаммов микроорганизмов, способных синтезировать гормоны, белки, лекарственные препараты основывается на знании генетических карт микроорганизмов. Генетические карты человека необходимы для медицинской генетики. Знания о локализации гена в определенной хромосоме используются при диагностике ряда наследственных заболеваний, а также в генной терапии для исправления структуры и функции генов.

Генная терапия – замена дефектных генов на неповрежденные, или исправление их структуры.

Для борьбы с наследственными, онкологическими и возрастными заболеваниями разрабатываются методы генной терапии, безопасные для клеток человека. С использованием методов генной терапии можно заменять в организме дефектные гены, в которых произошли точковые мутации, на неповрежденные. В наше время ученые осваивают методы биобезопасности человека: внедрение нужных генов в клетки организма человека. Это позволит избавиться от многих наследственных заболеваний.

Микробиологический синтез

Методы генной инженерии позволили осуществить микробиологический синтез (рис. 37 Б). С помощью методов генной инжененрии микробиологи смогли получить штаммы бактерий, благодаря которым успешно осуществляется микробиологический синтез. Для этого производится отбор необходимых бактериальных клеток, не содержащих плазмид. Выделяются молекулы ДНК с заданной последовательностью нуклеотидов, определяющих развитие нужного признака. Плазмида с встроенным участком ДНК (геном) вводится в бактериальную клетку, в которой встроенный участок ДНК начинает работать (идут процессы репликации, транскрипции, трансляции), и в бактериальной клетке синтезируется нужный белок (интерферон, генферон, иммуноглобулин, инсулин, соматотропин и др.). В промышленных количествах получены гормоны (инсулин, соматотропин), многие аминокислоты, антибиотики, вакцины и др. Такие бактерии размножают в промышленных масшабах и производят необходимый белок.

С помощью генетических методов получен штамм микроорганизма Pseudomonas denitrificans, который производит в десятки раз больше витамина C, витаминов группы B, чем исходная форма; новый штамм бактерии микрококкус глутамикус выделяет в сотни раз больше аминокислоты лизина, чем исходная (дикая) культура лизинобразующей бактерии.

Клеточная инженерия

Клеточная инженерия – культивирование отдельных клеток или тканей на специальных искусственных средах, разработка методов создания клеток нового типа путем их гибридизации, замены хромосом и выращивание из них гибридов.

1. Метод культуры тканей

Метод заключается в культивировании изолированных клеток или кусочков тканей на искусственной питательной среде в соответствующих микроклиматических условиях. В результате культивирования растительные клетки или кусочки ткани регенерируют в целое растение. Путем микроклонального размножения отдельных клеток, или кусочков тканей (чаще верхушечной меристемы стебля или корня) можно получить множество полезных растений. Микроклиматические условия и питательные среды для регенерации декоративных, культурных, лекарственных растений подбираются экспериментально. Культура тканей также используется для получения диплоидных растений после обработки исходных гаплоидных форм колхицином.

2. Соматическая гибридизация

Соматическая гибридизация включает получение гибридных клеток, а из них – новых форм; искусственное оплодотворение яйцеклеток.

Получение новых гибридных растений путемслияния протопластов (ядро и цитоплазма) различных клеток в культуре тканей. Для слияния протопластов с помощью ферментов разрушают стенку растительной клетки и получают изолированный протопласт. При культивировании таких протопластов разных видов растений осуществляется их слияние и образование форм с новыми полезными признаками. Искусственное оплодотворение яйцеклеток осуществляют посредством метода экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), позволяющего произвести оплодотворение яйцеклеток в пробирке с последующей имплантацией эмбриона на ранней стадии развития, и преодолеть некоторые формы бесплодия у человека.

3. Хромосомная инженерия – замена отдельных хромосом в клетках растений или добавление новых. У диплоидов имеются пары гомологичных хромосом, и такие организмы называются дисомики. Если в одной какой-либо паре оставить одну хромосому, то формируется моносомик. Если добавить в какую-либо пару третью гомологичную хромосому, то формируется трисомик и т. д. Возможна замена отдельных хромосом одного вида на хромосомы другого вида. Полученные формы называются замещенными .

БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

И БИОТЕХНОЛОГИЯ

«Познание определяется тем,

что утверждается нами

как Истина»

П. А. ФЛОРЕНСКИЙ.

Современная биология коренным образом отличается от традиционной биологии не только большей глубиной разработки познавательных идей, но и более тесной связью с жизнью общества, с практикой. Можно сказать, что в наше время биология стала средством преобразования живого мира с целью удовлетворения материальных потребностей общества. Это заключение иллюстрируется прежде всего тесной связью биологии с биотехнологией, которая стала важнейшей областью материального производства, равноправным партнером механической и химической технологий, созданных человеком ранее. Чем же объясняется взлет биотехнологии?

С момента своего возникновения биология и биотехнология всегда развивались совместно, причем с самого начала биология была научной основой биотехнологии. Однако длительное время недостаток собственных данных не позволял биологии оказывать очень большое влияние на биотехнологию. Положение резко изменилось с созданием во второй половине XX в. методологии генетической инженерии, под которой понимают генетическое манипулирование с целью "конструкции новых и реконструкции существующих генотипов. Являясь по своей природе методическим достижением, генетическая инженерия не привела к ломке сложившихся представлений о биологических явлениях, не затронула основных положений биологии подобно тому, как радиоастрономия не поколебала основных положений астрофизики, установление «механического эквивалента тепла» не привело к изменению законов теплопроводности, а доказательство атомистической теории вещества не изменило соотношений термодинамики, гидродинамики и теории упругости.

Генетическая инженерия открыла новую эру в биологии по той причине, что появились новые возможности для проникновения в глубь биологических явлений с целью дальнейшей характеристики форм существования живой материи, с целью более эффективного изучения структуры и функции генов на молекулярном уровне, понимания тонких механизмов работы генетического аппарата. Успехи генетической инженерии означают переворот в современном естествознании. Они определяют критерии ценности современных представлений о структурно-функциональных особенностях молекулярного и клеточного уровней живой материи. Современные данные о живом имеют гигантское познавательное значение, ибо обеспечивают понимание одной из важнейших сторон органического мира и тем самым вносят неоценимый вклад в создание научной картины мира. Таким образом, резко расширив свою познавательную базу, биология через генетическую инженерию оказала также ведущее влияние на подъем биотехнологии.

Генетическая инженерия создает заделы на пути познания способов и путей «конструирования» новых организмов или улучшения существующих организмов, придавая им большую хозяйственную ценность, большую способность резкого увеличения продуктивности биотехнологических процессов.

В рамках генетической инженерии различают генную инженерию и клеточную инженерию. Под генной инженерией понимают манипуляции с целью создания рекомбинантных молекул ДНК. Часто эту методологию называют молекулярным клонированием, клонированием генов, технологией рекомбинантных ДНК или просто генетическими манипуляциями. Важно подчеркнуть, что объектом генной инженерии являются молекулы ДНК, отдельные гены. Напротив, под клеточной инженерией понимают генетические манипуляции с изолированными отдельными клетками или группами клеток растений и животных.

Глава XIX

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Генную инженерию составляет совокупность различных экспериментальных приемов (методик), обеспечивающих конструкцию (реконструкцию) и клонирование молекул ДНК (генов) с заданными целями.

Методы генной инженерии используют в определенной последовательности (рис. 221), причем различают несколько стадий в выполнении типичного генно-инженерного эксперимента, направленного на клонирование какого-либо гена, а именно:

1. Выделение ДНК из клеток интересующего организма (исходного) и выделение ДНК-вектора.

2. Разрезание (рестрикция) ДНК исходного организма на фрагменты, содержащие интересующие гены, с помощью одного из ферментов-рестриктаз и выделение этих генов из образованной рестрикционной смеси. Одновременно разрезают (рестрикциируют) векторную ДНК, превращая ее из кольцевой структуры в линейную.

3. Смыкание интересующего сегмента ДНК (гена) с ДНК вектора с целью получения гибридных молекул ДНК.

4. Введение гибридных молекул ДНК путем трансформации в какой-либо другой организм, например, в Е. coli или в соматические клетки.

5. Высев бактерий, в которые вводили гибридные молекулы ДНК, на питательные среды, позволяющие рост только клеток, содержащих гибридные молекулы ДНК.

6. Идентификация колоний, состоящих из бактерий, содержащих гибридные молекулы ДНК.

7. Выделение клонированной ДНК (клонированных генов) и ее характеристика, включая секвенирование азотистых оснований в клонированном фрагменте ДНК.

ДНК (исходная и векторная), ферменты, клетки, в которых клонируют ДНК - все это называют «инструментами» генной инженерии.

Выделение ДНК

Рассмотрим методику выделения ДНК на примере ДНК плаз-мид. ДНК из плазмидосодержащих бактериальных клеток выделяют с помощью традиционной техники, заключающейся в получении клеточных экстрактов в присутствии детергентов и последующем удалении из экстрактов белков фенольной экстракцией (рис. 222). Полная очистка плазмидной ДНК от белков, РНК и других соединений проводится в несколько стадий. После того как клетки разрушены, например, с помощью лизоцима (растворены их стенки), к экстракту добавляют детергент, чтобы растворить мембраны и инактивировать некоторые белки. Большинство хромосомной ДНК удаляют из получаемых препаратов обычным центрифугированием.

Часто для полной очистки используют хроматографию. Если требуется очень тщательная очистка, используют высокоскоростное центрифугирование в градиенте плотности CsCI с использованием этидия бромида. Оставшаяся хромосомная ДНК будет фрагментирована в линейную, тогда как плазмидная ДНК останется ковалентно закрытой. Поскольку этидий бромид менее плотен, чем ДНК, то при ультрацентрифугировании в центрифужной пробирке будет «выкручиваться» два кольца - плазмидная ДНК и хромосомная ДНК (рис. 223). Плазмидную ДНК отбирают для дальнейшей работы, хромосомную ДНК выбрасывают.